微生物肥料實驗用培養基技術條件(NY/T 1114-2006)

2017-04-19  來自: 鶴壁市百惠生物科技有限公司 瀏覽次數:657

1 范圍

本標準規定了微生物肥料實驗室使用的培養基技術要求。

本標準適用于微生物肥料產品質量檢驗、菌種培養與保藏用培養基的制備。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。

GB/T 19524.1-2004   肥料中糞大腸菌群的測定

NY 527-2002         光合細菌菌劑

3 術語和定義

培養基 medium

由人工配制的適合微生物生長、代謝、繁殖和保存的營養基質。

4 培養基制備流程圖(略)

5 培養基選用原則

5.1 含有滿足所培養的微生物生長必需的營養物質。

5.2 各種營養物質要有合適的比例和濃度。 

5.3 有合適的pH范圍和一定的緩沖pH能力。

5.4 有一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

5.5 對于特殊用途的培養基,除遵循以上原則外,還應滿足以下要求:

5.5.1 在選擇培養基中,應加入利于目的微生物生長而抑制其它微生物生長的化學物質。

5.5.2 菌種保藏培養基選用原則

5.5.2.1 對于產芽孢或孢子的菌種保藏培養基應以易產生芽孢或孢子為原則。

5.5.2.2 對于自養微生物的菌種保藏培養基應只使用無機鹽類,不使用有機物。

5.5.2.3 對能利用無機氮源的微生物,其菌種保藏培養基中不宜使用有機氮源。

5.5.2.4 對營養缺陷型微生物,其菌種保藏培養基中必須含有該缺陷所需的物質。

5.5.2.5 對耐某種藥物的微生物,其菌種保藏培養基中應含有一定濃度的該種藥物。

6 要求

6.1 材料

6.1.1 用于配制培養基的化學試劑純度至少為化學純。

6.1.2 試劑出現顏色改變、沉淀、混濁、吸潮結塊的現象時,不宜使用。

6.1.3 天然原材料應質量穩定,未發生霉變、生蟲和變質。

6.1.4 瓊脂凝固后應具有良好的透明度。

6.2 器皿

6.2.1 配制試劑所用的器皿應潔凈。

6.2.2 盛裝培養基的器皿應由對微生物無毒害并耐高溫的材料制成。

6.2.3 材料需加熱溶解時,可選用玻璃容器、搪瓷缸和不銹鋼容器等,禁用銅制、鋁制和鐵制容器。

6.3 棉塞或硅膠塞

6.3.1 不應使用脫脂棉制作棉塞。

6.3.2 使用棉塞或硅膠塞時,將其長度的2/3塞入容器內。要求松緊適當,緊貼管壁。

6.3.3 滅菌時,棉塞外要加包牛皮紙或耐高溫透氣塑料薄膜,以防止滅菌時棉塞受潮或進水。

6.4 培養基配制

6.4.1 材料稱量

6.4.1.1 根據培養基配方,準確稱取相應材料的量。

6.4.1.2 當配方中某種成分微量時,可預先將該成分配制成一定濃度的母液,然后按量加入。母液須低溫保存。

6.4.2 材料溶解

6.4.2.1 不溶于水的組分應在所需的溶劑中溶解后,再加入到培養基中。

6.4.2.2 非溶性組分,如CaCO3,應最后加入。

6.4.2.3 易形成沉淀的組分應分別溶解。

6.4.2.4 不易溶解的組分應做預處理。加熱溶解過程中一旦出現焦化現象時應棄用。

6.4.2.5 培養基中含有指示劑或有顏色的試劑時,應在培養基pH調節好之后再加入。

6.4.3 pH測定與調節

6.4.3.1 用精密pH試紙或酸度計測定培養基的pH。

6.4.3.2 培養基的pH用稀酸或稀堿溶液調節。調節過程中不可用酸堿溶液反復調節。

6.4.4 分裝

裝入三角瓶的培養基體積不應超過其容量的1/2,裝入試管的培養基體積為其容量的1/4~1/5。分裝過程中防止培養基粘附在瓶口或管口。

6.4.5 滅菌

6.4.5.1 高壓蒸汽滅菌

高壓蒸汽滅菌控制的條件為121℃、維持30min。當培養基中含有不耐高溫的組分時,可采用115℃、維持15min~30min。

6.4.5.2 過濾除菌

在無菌條件下,將待除菌溶液經濾膜為φ≦0.2μm的細菌過濾器,達到除菌的目的。適用于易受高溫破壞、失活的物質的滅菌,如維生素。

6.4.5.3 干熱滅菌

將待滅菌的器皿,用紙包好或放在特定的容器內,置于烘箱中,在160℃左右保持2h。適用于培養皿等玻璃器皿的滅菌。

6.4.6 平板和斜面的制備

在無菌條件下把冷卻至45℃左右的培養基倒入無菌培養皿內,平板厚度范圍控制在3mm~5mm。制備的斜面長度不超過試管長度的2/5。

6.5 培養基合格檢驗

6.5.1 檢查固體培養基濕度。培養基冷凝水過多或干燥出現裂痕時,均不能使用。

6.5.2 隨機抽取已滅過菌的培養基放入28℃~30℃培養箱中培養24h~48h,確定無菌生長后方可使用。

6.6 培養基存放

培養基應放在冰箱4℃-~8℃保存。經過存放的培養基使用前應進行6.5的合格檢驗,合格后方可使用。

7 微生物肥料常用培養基配方、配制要點和用途

微生物肥料常用培養基配方、配制要點和用途參見附錄A。


 

附 錄 A
(規范性附錄)
 常用培養基配方

A.1 營養瓊脂

A.1.1 成分

蛋白胨                                      10.0 g

牛肉膏                                      3.0 g

氯化鈉(NaCl)                                5.0 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          7.2~7.5

A.1.2 配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內,調節pH,再加瓊脂,加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌30min。

A.1.3 用途

適用于一般細菌培養和保藏。

A.2 芽孢桿菌培養基

A.2.1 成分

蛋白胨                                      5.0 g

牛肉膏                                      3.0 g

土壤浸出液                                  250 mL

蒸餾水                                      750mL

瓊脂                                        18. 0 g

A.2.2 配制要點

土壤浸取液:土壤50g,加水200mL,121℃滅菌1h,過濾補水至250mL。

其他同A.1.2

A.2.3 用途

適用于芽孢桿菌的保藏。

A.3 阿須貝氏(Ashby)培養基

A.3.1 成分

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.2 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

氯化鈉(NaCl)                                0.2 g

碳酸鈣(CaCO3)                               5.0 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

硫酸鈣(CaSO4·2H2O)                       0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8~7.0

A.3.2 配制要點

同A.1.2

A.3.3 用途

用于固氮菌的培養。

A.4 根瘤菌培養基YM

A.4.1 成分

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

氯化鈉(NaCl)                                0.1 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

酵母膏                                      1.0 g

0.5%剛果紅溶液                              5 mL

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8~7.0

A.4.2 配制要點

將各種營養成分溶解于蒸餾水內,調節pH后,加入剛果紅溶液。再加瓊脂,加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌30min。

A.4.3 用途

適用于根瘤菌的培養。

A.5 根瘤菌培養基 = 2 \* ROMAN II

A.5.1 成分

酵母粉                                      1.0 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

土壤浸出液                                  200 mL

瓊脂                                        15.0 g

蒸餾水                                      800 mL

pH                                          7.2

A.5.2 配制要點

土壤浸出液:土壤50g,加水200mL,121℃滅菌1h,過濾補水至200mL。

其他同A.1.2

A.5.3 用途

適用于根瘤菌的保藏和培養。

A.6 硅酸鹽細菌培養基

A.6.1 成分

蔗糖(C12H22O11)                              5.0 g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)                   2.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

碳酸鈣(CaCO3)                               0.1 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.005 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          7.5~8.0

A.6.2 配制要點

先將三氯化鐵配制成5‰的溶液,按量加入,其他同A.1.2

A.6.3 用途

適用于硅酸鹽細菌的培養。

A.7 固氮(莖瘤)根瘤菌培養基

A.7.1 成分

乳酸鈉(C3H5O3Na)                           10.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.67 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.87 g

氯化鈉(NaCl)                                0.05 g

氯化鈣(CaCl2)                               0.04 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.004 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.1 g

酵母膏                                      1.0 g

瓊脂                                        18.0g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8~7.0

A.7.2 配制要點

先將三氯化鐵配制成4‰的溶液按量加入,其他同A.1.2。

A.7.3 用途

適用于莖瘤根瘤菌的培養。

A.8 馬丁培養基

A.8.1 成分

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           1.0 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          10.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

蛋白胨                                      5.0 g

1%孟加拉紅水溶液                            3.3 mL

氯霉素                                      0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.8.2 配制要點

將營養成分用蒸餾水溶解后,按量加入1%孟加拉紅水溶液,氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培養基中。再加瓊脂,加熱溶化后分裝。115℃高壓滅菌20min。

A.8.3 用途

適用于真菌的培養。

A.9 高氏合成一號瓊脂

A.9.1 成分

硝酸鉀(KNO3)                                1.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

氯化鈉(NaCl)                                0.5 g

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        0.01 g

可溶性淀粉(C6H10O5)n                          20.0 g

重鉻酸鉀(K2Cr2O7)                          0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                    1 000 mL

pH                                          7.2~7.4

A.9.2 配制要點

淀粉用少量冷水調成糊狀,加熱溶解后加入。再加瓊脂,加熱溶化后分裝,121℃高壓滅菌30min。重鉻酸鉀配制成溶液單獨滅菌,使用時再加入到培養基中。

A.9.3 用途

適用于放線菌的培養。

A.10 聯合固氮菌培養基

A.10.1 成分

D-葡萄糖酸鈉(C6H10NaO7)                       5.0 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.4 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.1 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

酵母膏                                      1.0 g

氯化鈉(NaCl)                                0.1 g

氯化鈣(CaCl2)                               0.02 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.01 g

鉬酸鈉(Na2MoO4)                            0.002 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8~7.0

A.10.2 配制要點

將氯化鈣配、鉬酸鈉分別配制成2‰的溶液,按量加入,其他同A.1.2。

A.10.3 用途

適用于固氮螺菌的培養。

A.11 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基

A.11.1 成分

馬鈴薯                                      200 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.11.2 配制要點

稱取去皮馬鈴薯200g切塊,放入水中煮沸30min,然后用雙層紗布過濾取汁,再加葡萄糖和瓊脂,溶化后補足水至1000mL,115℃滅菌20min。

A.11.3 用途

適用于酵母菌的培養。

A.12 麥芽汁瓊脂

A.12.1 成分

12波林麥芽汁(Brix)                        1 000 mL

瓊脂                                       18.0 g

pH                                          5.4

A.12.2 配制要點

將麥芽汁調至12波林的糖度,調節pH,加入瓊脂,加熱溶化后分裝。115℃高壓滅菌20min。

A.12.3 用途

適用于酵母菌的培養和保藏。

A.13 乳酸細菌培養基(MRS)

A.13.1 成分

蛋白胨                                      10.0 g

牛肉膏                                      10.0 g

酵母膏                                      5.0 g

檸檬酸氫二銨[(NH4)2C6H6O7]                        2.0 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g

吐溫80                                      1.0 g

乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)                     5.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     2.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.58 g

硫酸錳(MnSO4·H2O)     &nb, sp                     0.25 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.2~6.6

A.13.2 配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內,調節pH,再加瓊脂,加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌20min。

A.13.3 用途

適用于乳酸菌的培養。

A.14 光合細菌培養基 = 1 \* ROMAN I

A.14.1 成分

酵母粉                                      3.0 g

蛋白胨                                      3.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

氯化鈣(CaCl2)                             0.3 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8~7.0

A.14.2 配制要點

同A.1.2。

A.14.3 用途

適用于光合細菌的培養。

 

A.15 光合細菌培養基 = 2 \* ROMAN II

A.15.1 成分;

溶液 = 1 \* ROMAN I

氯化鈣(CaCl2)                             75 mg

乙酸鈉(CH3COONa)                          1.6 g

煙酸                                        40 mg

氯化鈉(NaCl)                                1.5 g

生物素                                      40 mg

酵母膏                                      2.0 g

硫胺素                                      40 mg

氯化鎂(MgCl2)                               200 mg

乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)溶液               5 mL

微量元素溶液                                1 mL

蒸餾水                                      800mL

溶液 = 2 \* ROMAN II

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           600 mg

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.18 g

蒸餾水                                      200 mL

將溶液 = 1 \* ROMAN I、溶液 = 2 \* ROMAN II分別于121℃高壓滅菌15min,冷卻后將溶液 = 1 \* ROMAN I、溶液 = 2 \* ROMAN II混勻。

微量元素溶液:

乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8·2H2O)        2.0 g

硼酸(H3BO3)                                100 mg

氯化鋅(ZnCl2)                             100 mg

高鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)                    20 mg

氯化銅(CuCl2)                             10 mg

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        2.0 g

氯化鈷(CoCl2·6H2O)                        100 mg

氯化錳(MnCl2·4H2O)                        100 mg

氯化鎳(NiCl2·6H2O)                        20 mg

亞硒酸鈉(Na2SeO3)                                             1 mg

蒸餾水                                      1 000 mL

乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)溶液:

乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Na2)                  20.0 g

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        20.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.15.2 配制要點

乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)溶液需要通氣過夜,維生素類物質要過濾除菌后按量加入到培養基中。。

A.15.3 用途

適用于光合細菌的培養。

A.16 乳糖膽鹽發酵培養基(用于大腸菌群初步發酵)

A.16.1 成分

蛋白胨                                      20.0 g

    豬膽鹽                                      5.0 g

    乳糖                                        10.0 g

0.04%溴甲酚紫溶液                           25.0 mL

    蒸餾水                                      1 000 mL

    pH                                          7.2~7.4

A.16.2 配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內,調節pH,然后加入溴甲酚紫溶液,分裝到試管中,并放入小倒管。115℃高壓滅菌15min。

A.16.3 用途

用于乳糖發酵實驗。

A.17 伊紅美藍瓊脂

A.17.1 成分

蛋白胨                                      10.0 g

    乳糖     &

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